امروز چهارشنبه 1 آذر 1396

طراحی RNA دو رشته‌ای با راندمان بالا برای ایجاد ناقل RNAi امگا گلیادین در گندم

Double stranded RNA design with high efficiency for RNAi vector omega gliadin in wheat

MGJ-15-B-00365

ژنتیک گیاهی

پژوهشی کامل

Fa

 

 

فناوری ریبونوکلئیک اسید مداخله‌گر (RNAi) به‌عنوان یک ابزار قدرتمند برای خاموشی بیان ژن هدفگیری شده برپایه تشابه توالی نوکلئوتیدی می‌باشد. RNA مداخله‌گر می‌تواند در کاهش بیان ژنی اپی‌توپ‌های امگا‌گلیادین که باعث ایجاد حساسیت غذایی وابسته به گندم (WDEIA) می‌شود، مورد استفاده قرار گیرد. حساسیت غذایی یا آنافیلاکسی وابسته به گندم از آنجا منشا می‌گیرد که آنتی‌بادی‌ها، به خصوص IgE در فرد بیمار، نقشی مخالف عمل محافظت کنندگی خود دارند. در گیاهان، RNA دو رشته‌ای با انتهای آزاد دو یا سه نوکلئوتیدی بخاطر قابلیت شناسایی با آنزیم Dicer یکی از ارکان مهم RNA مداخله‌گر محسوب می‌شود. بنابراین توجه به ایجاد انتهای آزاد ʹ3 با نوکلئوتید‌های گوانین-سیتوزین در RNAi دورشته‌ای اختصاصی ژن امگا گلیادین با عملکرد بالا هدف‌گیری شد. در این تحقیق عملکرد بالای ساختار ثانویه RNA دو رشته‌ای با محتوای نوکلئوتیدی گوانین-سیتوزین 35 تا 50 درصد بررسی شد. قطعات سنس و آنتی‌سنس طبق نقشه کاست در ناقل pTG19-T همسانه‌سازی شده و سپس برای تولید و ارزیابی مولکول RNAi مورد نظر به ناقل بیانی pAHC25 منتقل شد. انرژی آزاد موثر برای آنزیم Dicer، تغییرات نوکلئوتیدی برای نواحی RNA دو رشته‌ای و درصد گوانین-سیتوزین مورد ارزیابی اولیه قرار گرفتند. بطوری-که در ناحیه انتخابی برای ساخت کاست، میزان نوکلئوتید‌های گوانین- سیتوزین در حدود 7/35 الی 2/45 درصد و انرژی آزاد 7/24- الی 7/28- کیلوکالری برمول ارزیابی شد. پس از همسانه‌سازی موفق قطعه سنس، شباهت 100 درصدی برای ناحیه تشکیل دهنده ساقه‌سنجاق‌سری (hair-pin stem) به‌طول 185 جفت باز حاصل شد. طبق نقشه کاست توالی باقی‌مانده از قطعه سنس نیز نقش فاصله انداز و یا تشکیل دهنده لوپ در مولکول RNAiرا ایفا نمود. سرانجام، با انتقال کاست RNAi به ناقل بیانی pAHC25، ناقل خاموشی اختصاصی و با راندمان بالا برای ژن امگا گلیادین نوع D1 حاوی اپی‌توپ WDEIA تولید شد.

Nucleotide sequence homology based technology of interfering ribonucleic acid (RNAi) is a powerful tool for silencing targeted gene. RNAi technology can be used to reduce gene expression of omega-gliadin epitopes that cause food allergies related to wheat (WDEIA). The food allergy or wheat dependent anaphylaxis is originated from antibodies, especially IgE in the patient, which plays against their common protective role. In plants, RNA duplex with the free end of 2 or 3 nucleotides is accounted one of the important components of RNA interference due to recognizing capability of enzyme Dicer. So, attention to the guanine-cytosine nucleotides in free 3'end of omega-gliadin gene-specific RNAi duplex with high-performance has been targeted. In this study, high-performance double-stranded RNA secondary structure containing 35 to 50% cytosine-guanine nucleotides was investigated. The sense and antisense fragments were cloned according to work plan in pTG19-T cloning vector and then were transferred to the expression vector pAHC25 to produce and evaluate the RNAi molecules. Free effective energy of Dicer, nucleotide changes at the double-stranded RNA areas and the percentage of guanine-cytosine were initially assessed. So in selected area for construction of the cassette, cytosine-Guanine content of 35.7 to 45.2 % with free energy of 7/24 to 7/28 Kcal were evaluated. After the successful cloning of antisense fragment, 100 percent homology with a length of 185 bps was obtained for stem of hair-pin RNA molecule. According to the cassette plan, rest of the antisense sequence played spacer role or loop forming part at hair pin RNAi. At the end by transferring RNAi cassette to the expression vector pAHC25, efficient quenching vector of omega-gliadin gene type of D1 containing WDEIA epitopes was produced.

نویسندگان مقاله
ناممحل خدمتپست الکترونیکی

بهرام باغبان کهنه‌روز
b Baghban-Kohnehrouz

نویسنده مسئول

مهدی آذری آنپار
m Azari-Anpar

نویسنده مسئول

محمدعلی ابراهیمی
ma Ebrahimi

ma_ebrahimi[AT]pnu.ac.ir نویسنده مسئول

مقالات چاپ شده