امروز دوشنبه 25 تیر 1397

همسانه‌سازی ژن کراتیناز در اشرشیاکلی و بررسی برخی از خصوصیات بیوانفورماتیکی آن

Keratinase gene Cloning in Escherichia coli and investigating some of its bioinformatics features

MGJ-17-C-00273

ژنتیک جانوری

پژوهشی کامل

Fa

 

 

کراتیناز از آنزیم‌های پروتئولیتیک در طبیعت می‌باشد. این آنزیم تنها در حضور سوبسترای کراتین تولید می‌شود و عمدتاً پیوندهای دی‌سولفیدی را مورد هدف قرار می‌دهد. در این مطالعه از سویه باکتریاییBacillus licheniformis که قبلا از بستر مرغداری جدا شده بود، برای استخراج ژن کراتیناز استفاده شد. واکنش تکثیر ژن کراتیناز با روش PCR با استفاده از DNA ژنومی استخراج شده از باکتری بومی انجام شد. پس از خالص‌سازی، ژن کراتیناز با روش همسانه‌سازی T/A به ناقل pTZ57R/T منتقل شد. پس از انجام واکنش اتصال بین محصول PCR و حامل pTZ57R/T، ترنسفورم محصولات لایگیشن به باکتری اشرشیاکلی سویه DH5α صورت گرفت. انجام واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای F. B. 1 و R. B. 1 روی پلاسمید ker- pTZ57R/T، منجر به تکثیر ژن کراتیناز به‌طول 1164 جفت‌باز شد که دارای توالی‌ برش آنزیم‌های XhoI و NcoI برای انتقال مناسب به وکتور بیانی (+)pET-26b بودند. استخراج پلاسمید نوترکیب از کلنی‌های شناسایی شده صورت گرفت و به باکتری اشرشیاکلی سویه BL21 انتقال داده شد که رشد کلنی‌های باکتریایی بر روی محیط LB آگار حاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین نشان از انتقال موفقیت‌آمیز سازه ker-pET-26b(+) به این سویه داشت. تعیین توالی نوکلئوتیدی ژن مورد نظر انجام شد. وزن مولکولی پس از ترجمه توالی نوکلئوتیدی به توالی پروتئینی معادل 88/39879 کیلو دالتون تخمین زده شد. بار خالص پروتئین معادل 009/0- با ضریب آلیفاتیک 73/84 و دارای سیگنال پپتیدی می‌باشد. این آنزیم یک سرین پروتئاز با جایگاه‌های فعال اسیدآمینه آسپارتیک 137، هیستیدین 168 و اسید آمینه سرین 325 می‌باشد. به‌طورکلی نتایج مطالعات بیوانفورماتیکی نشان می‌دهد که آنزیم کراتیناز مورد مطالعه در دسته آنزیم‌های پایدار قرار می‌گیرد که قابلیت استفاده در صنایع مختلف را دارا می‌باشد.

Keratinases is the proteolytic enzymes in the nature. This enzyme is produced only in the presence of keratin substrate. That targets the disulfide bonds. In this study, keratinases gene was extracted from the bacterial strain Bacillus licheniformis was previously isolated from poultry litter. Amplification reaction was performed using DNA extracted from native bacteria as the template. After purification, keratinases gene was cloned in pTZ57R/T vector. After ligation, ker-pTZ57R/T construct was transferred into susceptible E. coli bacteria strain DH5α. PCR reactions using primers FB1 and RB1 on ker-pTZ57R/T construct, leading to gene amplification keratinases 1164 bp length with cut site XhoI and NcoI restriction enzymes for the transfer into appropriate expression pET-26b(+) vector. The recombinant plasmid, ker-pET-26b(+), was extracted from positive colonies on LB agar with kanamycin antibiotic and was transferred into E. coli strain BL21. Keratinases cloned gene was sequenced. In the analysis of bioinformatics, molecular weight protein sequence of the nucleotide sequence was estimated at ~ 40 kDa. Protein net charge equal to -0.009 with aliphatic ratio is 84/73 and has the signal peptide. This enzyme is a serine protease with active sites aspartic acid 137, amino acid histidine 168 and serine 325. In general, the results of this bioinformatics studies indicated that the keratinase enzyme is considered to be a category of endogenous enzymes that can be used in various industries.

نویسندگان مقاله
ناممحل خدمتپست الکترونیکی

سمیه رحیم‌نهال
S Rahimnahal

نویسنده مسئول

جمال فیاضی
J Fayazi

j_fayazi[AT]ramin.ac.ir نویسنده مسئول

امیر میمندی‌پور
A Meimandipour

meimandi[AT]nigeb.ac.ir نویسنده مسئول

محمد تقی بیگی نصیری
MT Beigi Nassiri

نویسنده مسئول

مهدی شمس آرا
M Shamsara

نویسنده مسئول

علی اصغر کارخانه‌ای
AA Karkhane

نویسنده مسئول

مقالات چاپ شده