امروز جمعه 25 آبان 1397

شناسایی، جداسازی و بررسی خصوصیات خانواده ژنی دیفنسین در گیاه عدس (Lens culinaris L.)

Identification, isolation and characterization of defensin gene family in lentil (Lens culinaris L.)

MGJ-17-B-00491

ژنتیک گیاهی

پژوهشی کامل

Fa

 

 

دیفنسین‌های گیاهی، خانواده‌ای از پپتیدهای ضد میکروبی کاتیونی غنی از سیستئین هستند. این پپتیدها مولکول‌هایی کوچک با وزن مولکولی 5 تا 7 کیلودالتون هستند که دارای هشت اسید آمینه سیستئین محافظت شده بوده که در ایجاد پل‌های دی‌سولفیدی نقش دارند. در مطالعه حاضر با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی، خانواده ژنی دیفنسین از گیاه عدس جداسازی و تعیین خصوصیت شد. به این منظور تمام توالی‌های نوکلئوتیدی مربوط به ژن‌های دیفنسین گیاهان دو لپه‌ای (583 توالی) از بانک ژن دریافت شد. توالی‌های دریافت شده، علیه کتابخانه EST گیاه عدس (9539 مورد EST) همردیف و نتایج حاصل با هم مخلوط و سر هم‌بندی شدند. قطعات سرهم بندی شده (کانتیگ‌ها) و قطعات غیر سر هم‌بندی شده (سینگلتون‌ها) با استفاده از BLASTn، علیه پایگاه داده nr همردیف شدند. کانتیگ‌ها و سینگلتون‌های حاصل، برای وجود چارچوب خوانش باز کامل، دمین‌های عملکردی، سیگنال پپتید، محل تجمع سلولی، خصوصیات فیزیکوشیمیایی، فراوانی اسیدهای آمینه، فعالیت ضد میکروبی و الگوی بیان مورد بررسی بیشتر قرار گرفتند. در نهایت با استفاده از واکنش PCR توالی کد کننده کامل دیفنسین‌ها تکثیر و به صورت آزمایشگاهی تأیید شد. نتایج، وجود 6 کانتیگ که حاوی چارچوب‌های خوانش باز به طول 222 تا 228 جفت باز بودند را مشخص کرد. توالی پروتئینی دیفنسین‌های شناسایی شده، حاوی دمین عملکردی Knot1 (Gamma-thionin) بود. این دیفنسین‌ها دارای سیگنال پپتید بودند و تجمع خارج سلولی داشتند. به علت فراوانی بالای اسیدهای آمینه آبگریز، دیفنسین‌های شناسایی شده آبگریز بوده و ساختارهای ثانویه پیچیده‌ای تولید می‌کردند. نتایج آنالیز ضد میکروبی in silico، فعالیت ضد میکروبی بالا را در دیفنسین‌های جداسازی شده نشان داد. آنالیز بیان ژن in silico، الگوی متفاوتی از بیان را برای دیفنسین‌ها نشان داد. شناسایی توالی کد کننده ژن‌های ضد میکروبی و بررسی خصوصیات آن‌ها اولین قدم در مهندسی ژنتیک است. در این پژوهش برای اولین بار، توالی کد کننده کامل 6 ژن از ژن‌های خانواده دیفنسین از گیاه عدس جداسازی شد و ساختار و ویژگی‌ها و الگوی بیانی آن‌ها مشخص شد.

Plant defensins are a family of cysteine-rich cationic antimicrobial peptides. They are small molecules with molecular mass between 5 and 7kD and eight conserved cysteines that are involved in disulfide bond formation. In the present study, using bioinformatics tools, the defensin gene family were isolated and characterized from lentil. All nucleotide sequences of the defensin genes of dicotyledon plants (583 sequences) were retrieved from GenBank. The retrieved sequences were aligned against lentil EST library (9539 ESTs) and the resulted sequences were pooled and assembled. By using BLASTn tool, the assembled (contigs) and non-assembled (singletons) fragments were aligned against GenBank nr database. The resulted contigs and singletons were further analyzed for presence of complete ORFs, functional domains, signal peptides, subcellular localization, physicochemical properties, amino acid frequency, antimicrobial activity and expression pattern. Finally, by using PCR, complete coding sequence of defensins were amplified and experimentally validated. The results determined the existence of 6 contigs that contained ORFs of 222 to 228 bp. The protein sequences of identified defensins contained Knot1 (Gamma-thionin) functional domain. These defensins had signal peptides and extracellular localization. Due to high frequency of hydrophobic amino acids, the identified defensins were hydrophobic and produced complex secondary structures. The results of antimicrobial analysis showed high antimicrobial activity in the identified defensins. The gene expression analysis, showed a different pattern of expression for defensins. The identification and characterization of antimicrobial genes is the first step in genetic engineering. For first time in this study, full length coding sequence of defensin gene family was isolated from lentil and structures, features and expression pattern of them were determined.

نویسندگان مقاله
ناممحل خدمتپست الکترونیکی

رضا میر دریکوند
r mirdrikvand

drikvand_r[AT]yahoo.com نویسنده مسئول

سید محسن سهرابی
sm sohrabi

نویسنده مسئول

کامران سمیعی
k samie

نویسنده مسئول

علی قربانی
A ghorbani

نویسنده مسئول

مقالات چاپ شده