علی امامی پور، هومن رضایی نیک، علیرضا سیفی،
دوره ۱۷، شماره ۴ - ( ۱۲-۱۴۰۱ )
چکیده
ویرایش ژنوم مبتنی بر فناوری CRISPR/Cas۹ (کریسپر) به عنوان ابزار قدرتمندی برای اصلاح گیاهان زراعی بسرعت در حال گسترش است. یکی از مزایای این فناوری امکان دستورزی ژنهای هدف بدون درج DNA خارجی در گیاه است. برای این منظور نیاز است که آنزیم Cas۹ و RNA راهنما بصورت کمپلکس پروتئین-RNA (RNP) به سلول گیاهی منتقل شود. از اینرو تولید Cas۹ در آزمایشگاه مقدمه آزمایشات کریسپر مبتنی بر RNP است.هدف این پروژه بیان و تخلیص آنزیم Cas۹ در باکتری E. coli میباشد. در این پژوهش ژن Cas۹ در ناقل بیانی pBADM۳۰ کلون و به باکتری E. coliسویهی CodonPlus منتقل شد. بیان Cas۹ با اعمال ۲/۰ درصد L-Arabinose القا شد و سپس از کل پروتئین محلول جداسازی شد. سپس آنزیم Cas۹ توسط با استفاده از ستون میل ترکیبی نیکل تخلیص شد. حضور Cas۹ در پروتئین کل و پروتئین تخلیص شده با استفاده از الکتروفورز SDS-PAGE تایید شد. نتایج حاصل از کلونی PCR و هضم دوگانه ی آنزیمی وجود ژن Cas۹ در ناقل pBADM۳۰ را تایید نمود. نتایج SDS-PAGE حضور پروتئین با وزن ملکولی حدود ۱۸۰ kDa را در پروتئین کل نشان داد. همچنین وجود یک تک باند با وزن ملکولی حدود ۱۸۰ kDa در دو فرگشن بافر شستشو ی حاصل ار رزین نیکل نشان داد که پروتئین هدف به درستی تخلیص شده است. آنزیم Cas۹ در باکتری E.coli با موفقیت بیان و تخلیص شد. با توجه به نتایج به دست آمده میتوان گفت که پس از سنجش فعالیت کاتالیکی آنزیم Cas۹ میتوان از این آنزیم به همراه RNA راهنما و ساخت کمپلکس RNP و انتقال آن به گیاه با روش پروتوپلاست یا الکتروپوریشن در پژوهش های بعدی استفاده کرد
