fa بهینه سازی بیان آنزیم سلوبیوهیدرولاز cel6B در باکتری E. coli BL21(DE3) ژنتیک ریزسازواره Subject 04 پژوهشی کامل Applicable مصرف انرژی و تاثیر آن بر محیط‌زیست یکی از بزرگترین چالش‌های بشر است و تولید اتانول زیستی یا سایر مواد شیمیایی به وسیله هیدرولیز آنزیمی سلولز می‌تواند تاثیر مهمی در جایگزینی سوختهای فسیلی و کاهش تولید <span dir="LTR">CO₂</span> در اتمسفر داشته باشد. آنزیم <em><span dir="LTR">Cel6B</span></em> از باکتری گرمادوست <em><span dir="LTR">Thermobifidia fusca</span></em>، یک <span dir="LTR">CBHII</span> متعلق به خانواده بی سلولازهاست که تا <span dir="LTR">C</span>&deg; 55 مقاوم به حرارت است. به علت میزان پایین تولید این آنزیم در میزبان اولیه جهت مصارف صنعتی، ابتدا باید تولید آن در سیستم‌هایی نظیر باکتری، بهینه‌سازی شود. در این پژوهش، از آغازگرهای اختصاصی جهت تایید وجود ژن <em><span dir="LTR">Cel6B</span></em> در وکتور <span dir="LTR">PSZ143</span> استفاده شد سپس وکتور <span dir="LTR">PSZ143</span> حاوی ژن <em><span dir="LTR">Cel6B</span></em> با روش شوک حرارتی به سلول‌های مستعد <em><span dir="LTR">E. coli</span></em><span dir="LTR"> BL21(DE3)</span> منتقل شد. پس از استخراج پروتئین، بیان یک پروتئین با وزن مولکولی <span dir="LTR">59.6 KDa</span> با استفاده از ژل الکتروفورز <span dir="LTR">SDS-PAGE</span> تایید شد. نتایج بهینه‌سازی تولید پروتئین نشان داد که بهترین زمان و بهترین غلظت <span dir="LTR">IPTG</span> برای القا و بیان پروتئین در باکتری به ترتیب 6 ساعت بعد از القا و 8/0 میلی‌مولار است. فعالیت آنزیم سلوبیوهیدرولاز با استفاده از سوبسترای پنبه پیش‌تیمار شده با اسید فسفریک در باکتری لیزشده با روش <span dir="LTR">DNS</span> مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت آنزیمی <em><span dir="LTR">cel6B</span></em> در هیدرولیز سلولز، در لیزات باکتری و محیط<span dir="LTR">‌</span>کشت آن پس از 6 ساعت القا با 8/0 میلی<span dir="LTR">‌</span>مولار از <span dir="LTR">IPTG</span> ، به ترتیب 21/1 و <span dir="LTR">U(</span><span dir="LTR">m</span><span dir="LTR">mol/min) / ml</span> 07/0 به دست آمد و در نهایت نشان داده شد که میزان بیان پروتئین <em><span dir="LTR">cel6B</span></em> به علت پایین بودن شاخص <span dir="LTR">CAI</span> (انطباق کدونی) و تفاوت کدون‌های مورد ترجیح <em><span dir="LTR">E. coli</span></em>، پایین است. همچنین با بررسی توالی سیگنال بومی این ژن در سرویس‌دهنده <span dir="LTR">Signal P4.1</span> عدم قابلیت ترشح این پروتئین در <em><span dir="LTR">E. coli</span></em> اثبات شد. Energy consumption and its impact on the environment is one of the greatest human challenges and the production of bioethanol or other chemicals by cellulose enzyme hydrolysis can have an important effect in replacing fossil fuels and reducing of CO₂ production in the atmosphere. The <em>Cel6B</em> enzyme from <em>Thermobifidia fusca</em>, a thermal actinomist, a CBHII, belongs to the family of cellulases B, which is highly resistant to heat. Due to the low level of production of this enzyme in the primary host for industrial use, it must be optimized in systems such as bacteria. In this research, specific primers were used to confirm the presence of <em>Cel6B</em> gene in PSZ143 vector. Then, the PSZ143 vector containing the <em>Cel6B</em> gene was transferred by heat shock to <em>E. coli</em> BL21 (DE3) competent cells. After protein extraction, expression of a protein with a molecular weight of 59.6 KDa was confirmed using SDS-PAGE. Optimization results of protein production showed that the best time and best concentration of IPTG for induction and expression of the protein in <em>E. coli</em> was obtained 6 hours after induction and 0.6 mM, respectively. Also, cellobiohydrolase (CBH) activity on Phosphoric acid pretreated cotton (PC) substrate in lysed bacteria, was investigated by DNS method. The enzyme activity of <em>cel6B</em> in cellulose hydrolysis, in bacterial lysis and its culture media was obtained after IPTG induction of 0.8 mM, 1.21 and 0.07 U(mmol/min)/ml, respectively. Finally It has been shown that the expression of the cel6B protein is low due to the low CAI (Codon Adaptation Index) and the difference in codons preferred by E. coli. Also, by checking the native signal sequence of the <em>cel6B </em>gene in the Signal P4.1 server, the inability to secrete this protein in E. coli was proven. القای بیان پروتئین, باکتری, سلوبیوهیدرولاز, سلولز Bacteria, Cellobiohydrolase (CBH), Induction of protein expression, Cellulose 263 270 http://mg.genetics.ir/browse.php?a_code=A-10-193-1&slc_lang=fa&sid=1 Fahimeh Heydari gharehsoo فهیمه حیدری قره سو fahimehheidarigharehsoo@gmail.com 10031947532846005964 10031947532846005964 No دانشگاه فردوسی Nasrin Moshtaghi نسرین مشتاقی nasrinmoshtagi@yahoo.com 10031947532846005965 10031947532846005965 Yes دانشگاه فردوسی Baratali Meshkani براتعلی مشکانی mashkaniba@mums.ac.ir 10031947532846005966 10031947532846005966 No دانشگاه علوم پزشکی مشهد، دانشکده پزشکی مشهد Saeid Malekzadeh-shafarudi سعید ملکزاده شفارودی malekzadeh-s@um.ac.ir 10031947532846005967 10031947532846005967 No دانشگاه فردوسی