Modern Genetics Journal

fa روش غربال‌گری ژنتیکی برای ریزجلبک‌های تراریخت هسته‌ای Chlamydomonas reinhardtii با قابلیت بالای بیان ژن‌های خارجی Genetic screening method for Chlamydomonas reinhardtii lines efficiently expressing nuclear transgenes ژنتیک گیاهی Subject 01 پژوهشی کامل Applicable <div style="text-align: justify;">ریزجلبک سبز تک سلولی Chlamydomonas reinhardtii به عنوان یک بیوراکتور پتانسیل‌دار جهت تولید مولکول‌های صنعتی مانند سوخت‌های زیستی، پروتئین‌های درمانی یا آنزیم‌های صنعتی معرفی می‌شود. بیان پروتئین‌های هترولوگ در ژنوم هسته C. reinhardtii در مقایسه با کلروپلاست آن دارای چندین مزیت از جمله امکان بیان پروتئین‌های ترشحی و تخلیص آن‌ها و همچنین اعمال تغییرات پیچیده پس از ترجمه پروتئین‌ها مانند گلیکوزیلاسیون ‌می‌باشد. اما درج تصادفی سازه‌ ژنی در ژنوم و اثرات موقعیتی درج سازه در ژنوم یکی از مهم‌ترین معایب بیان ژن در هسته است. چراکه به دلیل درج تصادفی سازه بیانی در مناطق هتروکروماتینی که از لحاظ بیان ژن غیرفعال هستند، سیستم بیان‌کننده ژن خاموش و غیر فعال می‌ شود. در این پژوهش، روش ژنتیکی کارآمدی برای غربال‌گیری و گزینش ریزجلبک‌های تراریخت هسته‌ای C. reinhardtii طراحی و بهینه‌سازی شد. این روش ژنتیکی بر اساس سیستم بیان‌کننده ژن  YFPمبتنی بر فعالیت پروتئین T7 RNAپلی‌مراز طراحی شد. جهت پیاده‌سازی این سیستم به سازه کلروپلاستی حاوی ژن YFP تحت کنترل راه‌انداز T7 و سازه هسته‌ای دربردارنده ژن T7 RNAپلی‌مراز نیاز بود. بعد از همسانه‌سازی سازه‌های بیانی مذکور، ابتدا لاین‌های ترانس‌پلاستومیک هموپلاسم ایجاد شده و سپس این لاین‌ها با سازه هسته‌ای سوپرترنسفرم شدند. به واسطه رونوشت‌برداری از این RNAپلی‌مراز رمزشونده در هسته و انتقال پروتئین آن به کلروپلاست، رونویسی از ژن YFP تحت کنترل راه‌انداز T7 درج شده در ژنوم کلروپلاستی انجام گرفت و در نتیجه تحت تابش ماوراء بنفش، طیف وسیعی از سیگنال فلورسنت حاصل از پروتئین YFP از لاینهای تراریخت ساطع شد. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که این روش غربال ژنتیکی برای گزینش لاین‌های تراریخت کلامیدوموناس که حاوی سازه هسته‌ای در قسمت یوکروماتین و فعال‌تر رونویسی است، به خوبی می‌تواند مورد بهره‌برداری قرار گیرد. در واقع، این روش ژنتیکی نه تنها درج ژن در قسمت‌های یوکروماتینی و فعال رونویسی ژنوم را تایید کرده، بلکه لاین‌های با قابلیت بیش‌تر جهت بیان ژن خارجی را نیز شناسایی می‌کند. این روش ژنتیکی قابلیت تعمیم به گیاهان عالی که دارای کلروپلاست می باشند را نیز داراست.</div> Genetic screening method for Chlamydomonas reinhardtii lines efficiently expressing nuclear transgenes Mohammad Ali Abbasi-Vineh1, Masoumeh Emadpour 1*, Rouhollah Barahimipour 2 1- Ph.D. Student, Assistant Professor, Department of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran 2- Researcher, Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Potsdam, Germany * Corresponding Author; Email: <a href="mailto:m.emadpour@modares.ac.ir">m.emadpour@modares.ac.ir</a> Abstract The unicellular green microalga Chlamydomonas reinhardtii is introduced as a potential platform for the production of industrial molecules such as biofuels, therapeutic proteins, or industrial enzymes. Expressing nuclear transgenes offers several advantages compared to that in chloroplast, including the expression and purification of secreted proteins as well as the ability to perform post-translational modifications such as glycosylation. However, the random gene insertion resulting in positional effects on gene expression or gene insertion in transcriptionally silent regions is a limitation of gene expression in the nucleus. In current study, a genetic method was designed and optimized for the screening and selection of nuclear transgenes in C. reinhardtii. The genetic method was designed based on YFP gene expression system driven by the T7 RNA polymerase protein. To do this, a chloroplast expression cassette containing the YFP gene under the control of the T7 promoter and a nuclear cassette expressing the T7 RNA polymerase gene were cloned. Having obtained the stable homoplasmic transplastomic lines, they were super-transformed with the nuclear expression cassette. The results showed a wide range of fluorescent signal emission in super-transformed lines expressing YFP protein. In fact, the more nucleus-encoded RNA polymerase was transcribed and then translated to transfer the protein into the chloroplast, the more transcription of the YFP gene controlled by the T7 promoter was achieved. The results showed that the genetic screening method could be well applied not only to screen Chlamydomonas lines harboring the expression cassette inserted into transcriptionally active genomic regions but also to select the lines with a greater ability for transgene expression. ژنوم هسته‌ای, بیان ژن, پروتئین نوترکیب, RNA T7پلی‌مراز Nuclear genome, Gene expression, Recombinant protein, T7 RNA polymerase 35 47 http://mg.genetics.ir/browse.php?a_code=A-10-477-1&slc_lang=fa&sid=1 Mohammad Ali Abbasi-Vineh محمدعلی عباسی وینه ali.abbasi@modares.ac.ir 10031947532846008157 10031947532846008157 No Tarbiat Modares University دانشگاه تربیت مدرس Masoumeh Emadpour معصومه عمادپور m.emadpour@modares.ac.ir 10031947532846008158 10031947532846008158 Yes Tarbiat Modares University دانشگاه تربیت مدرس Rouhollah Barahimipour روح الله براهیمی پور barahimipour@mpimp-golm.mpg.de 10031947532846008159 10031947532846008159 No Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology انستیتو ماکس پلانک فیزیولوژی مولکولی