fa بیان و تخلیص آنزیم Cas9 در باکتری E. coli ژنتیک گیاهی Subject 01 پژوهشی کامل Applicable <span dir="RTL">ویرایش ژنوم مبتنی بر فناوری </span>CRISPR/Cas9<span dir="RTL"> (کریسپر) به عنوان ابزار قدرتمندی برای اصلاح گیاهان زراعی بسرعت در حال گسترش است. یکی از مزایای این فناوری امکان دستورزی ژن&shy;های هدف بدون درج </span>DNA<span dir="RTL"> خارجی در گیاه است. برای این منظور نیاز است که آنزیم </span>Cas9<span dir="RTL"> و </span>RNA <span dir="RTL">&nbsp;راهنما بصورت کمپلکس پروتئین-</span>RNA<span dir="RTL"> (</span>RNP<span dir="RTL">) به سلول گیاهی منتقل شود. از اینرو تولید </span>Cas9<span dir="RTL"> در آزمایشگاه مقدمه آزمایشات کریسپر مبتنی بر </span>RNP<span dir="RTL"> است.هدف این پروژه بیان و تخلیص آنزیم </span>Cas9<span dir="RTL"> در باکتری </span><em>E. coli </em><span dir="RTL">می&shy;باشد. در این پژوهش ژن</span> Cas9<span dir="RTL"> در ناقل بیانی </span>pBADM30<span dir="RTL"> کلون و به باکتری </span>&nbsp;<em>E. coli</em><span dir="RTL">سویه&shy;ی </span>CodonPlus<span dir="RTL"> منتقل شد. بیان </span>Cas9<span dir="RTL"> با اعمال 2/0 درصد </span>L-Arabinose <span dir="RTL">&nbsp;القا شد و سپس از کل پروتئین محلول جداسازی شد. سپس آنزیم </span>Cas9<span dir="RTL"> توسط با استفاده از ستون میل ترکیبی نیکل تخلیص شد. حضور </span>Cas9 &nbsp;<span dir="RTL">در پروتئین کل و پروتئین تخلیص شده با استفاده از الکتروفورز </span>SDS-PAGE<span dir="RTL"> تایید شد. نتایج حاصل از کلونی </span>PCR<span dir="RTL"> و هضم دوگانه ی آنزیمی وجود ژن </span>Cas9<span dir="RTL"> در ناقل </span>pBADM30<span dir="RTL"> را تایید نمود. نتایج&nbsp; </span>SDS-PAGE<span dir="RTL"> حضور پروتئین با وزن ملکولی حدود </span>180 kDa<span dir="RTL"> را در پروتئین کل نشان داد</span>.<span dir="RTL"> همچنین وجود یک تک باند با وزن ملکولی حدود </span>180 kDa<span dir="RTL"> در دو فرگشن بافر شستشو ی حاصل ار رزین نیکل نشان داد که پروتئین هدف به درستی تخلیص شده است. آنزیم </span>Cas9<span dir="RTL"> در باکتری </span>&nbsp;<em>E.coli </em><span dir="RTL">&nbsp;با موفقیت بیان و تخلیص شد. با </span><span dir="RTL">توجه به نتایج به دست آمده می&shy;توان&nbsp; گفت که پس از سنجش فعالیت کاتالیکی آنزیم </span>Cas9<span dir="RTL"> می&shy;توان از این آنزیم به همراه</span> &nbsp;RNA<span dir="RTL"> راهنما و ساخت کمپلکس </span>RNP<span dir="RTL"> و انتقال آن به گیاه با روش پروتوپلاست یا الکتروپوریشن در پژوهش های بعدی استفاده کرد</span> Genome editing based on CRISPR/Cas9 technology is rapidly expanding as a powerful tool for crop breeding. One of the advantages of this technology genome editing without introducing foreign DNA into plant genome.to achieve this, Cas9 and guide RNA need &nbsp;delivered &nbsp;to plant cell in form of protein-RNA complex (RNP). Hence the production of Cas9 enzyme in laboratory is the first step of CRISPR based on RNP method. Here, we evaluated the expression and purification of recombinant Cas9 protein in <em>E. coli. </em>In this study Cas9 gene was cloned into pBADM30 vector and transferred to the <em>E. coli &nbsp;</em>CodonPlus strain. The result of colony PCR and double digest confirmed the presence of Cas9 gene into pBAD vector. Cas9 expression was induced by applying 0.2% L-Arabinose and then isolated from the total soluble protein. Cas9 protein was also purified from cell crude extract using Nickel affinity chromatography. The purification was analyzed by SDS-PAGE and show the presence of a 180 kDa band in the fraction collected during the elution step. The Cas9 protein in E. coli was successfully expressed and purified. According to the obtained results, it can be said that after measuring the catalytic activity of Cas9 enzyme, this enzyme can be used together with guide RNA and fabrication of RNP complex and its transfer to the plant by protoplast or electroporation method in further research.<span dir="RTL"></span> اشرشیاکلای, ریبونوکلئوپروتئین, کریسپر CRISPR, Genome editing, Protoplast, Ribonucleoprotein, RNP 463 470 http://mg.genetics.ir/browse.php?a_code=A-10-358-1&slc_lang=fa&sid=1 ali emamipour علی امامی پور emamipoor.ali@gmail.com 10031947532846007346 10031947532846007346 No Ferdowsi University of Mashhad دانشگاه فردوسی مشهد hooman rezainik هومن رضایی نیک hmrnik@gmail.com 10031947532846007347 10031947532846007347 No Ferdowsi University of Mashhad دانشگاه فردوسی مشهد alireza seifi علیرضا سیفی arseifi@um.ac.ir 10031947532846007348 10031947532846007348 Yes Ferdowsi University of Mashhad دانشگاه فردوسی مشهد